Скорость ферментативной реакции

Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. Скорость определяют по углу наклона касательной к кривой на начальной стадии реакции.

Рис. 2 Скорость ферментативной реакции.

Чем круче наклон, тем больше скорость. Со временем скорость реакции обычно снижается, по большей части в результате снижения концентрации субстрата.

Факторы, влияющие на ферментативную активность

Действие Ф. зависит от ряда факторов: температуры, реакции среды (pH), концентрации фермента, концентрации субстрата, от присутствия специфических активаторов и неспецифических или специфических ингибиторов.

Концентрация фермента

При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.

Рис. 3 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

Катализ осуществляется всегда в условиях, когда концентрация фермента гораздо ниже концентрации субстрата. Поэтому с возрастанием концентрации фермента растет и скорость ферментативной реакции.

Температура

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции может быть выражено через температурный коэффициент Q 10: Q 10 = (скорость реакции при (х + 10)°C) / (скорость реакции при х °C)

В пределах 0-40°C Q 10 ферментативной реакции равен 2. Иными словами, при каждом повышении температуры на 10°C скорость ферментативной реакции удваивается.

Рис. 4 Влияние температуры на активность такого фермента, как амилаза слюны.

С повышением температуры движение молекул ускоряется, и у молекул реагирующих веществ больше шансов столкнуться друг с другом. Увеличивается, следовательно, и вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность, называется оптимальной. За пределами этого уровня скорость ферментативной реакции снижается, несмотря на увеличение частоты столкновений. Происходит это вследствие разрушения вторичной и третичной структур фермента, иными словами, вследствие того, что фермент претерпевает денатурацию.

Рис. 5 Ход ферментативной реакции при разных температурах.

Когда температура приближается к точке замерзания или оказывается ниже ее, ферменты инактивируются, но денатурации при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем белки оводненные (в виде белкового геля или раствора), инактивирование Ф. в сухом состоянии происходит гораздо медленнее, чем в присутствии влаги. Поэтому сухие споры бактерий или сухие семена могут выдержать нагревание до гораздо более высоких температур, чем те же споры или семена в увлажненном состоянии.

Концентрация субстрата

При данной концентрации фермента скорость ферментативной реакции возрастает с увеличением концентрации субстрата.

Рис. 6 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

Теоретическая максимальная скорость реакции V max никогда не достигается, но наступает момент, когда дальнейшее увеличение концентрации субстрата уже не влечет за собой сколько-нибудь заметного изменения скорости реакции. Это следует объяснить тем, что при высоких концентрациях субстрата активные центры молекул Ф. в любой данный момент оказываются практически насыщенными. Таким образом, сколько бы ни было в наличии избыточного субстрата, он может соединиться с Ф. лишь после того, как образовавшийся ранее фермент-субстратный комплекс диссоциирует на продукт и свободный Ф. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость ферментативной реакции лимитируется и концентрацией субстрата, и временем, которое требуется для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

При постоянной температуре любой Ф. работает наиболее эффективно в узких пределах pH. Оптимальным считается то значение pH, при котором реакция протекает с максимальной скоростью.

Рис. 7 Зависимость активности фермента от pH.

При более высоких и более низких pH активность Ф. снижается. Сдвиг pH меняет заряд ионизированных кислотных и основных групп, от которого зависит специфичная форма молекул Ф. В результате изменяется форма молекул Ф., и в первую очередь форма его активного центра. При слишком резких сдвигах pH Ф. денатурирует. Свойственный данному Ф. оптимум pH не всегда совпадает с pH его непосредственного внутриклеточного окружения. Это позволяет предположить, что среда, в которой находится Ф., в какой-то мере регулирует его активность.

Как известно, скорость химической реакции, согласно эмпирическому правилу Вант-Гоффа, при повышении температуры на 10 о увеличивается в 2-4 раза. Однако для ферментативных реакций оно соблюдается лишь до 50-60 о С. При более высоких температурах фермент, представляющий собой белок, денатурирует, изменяется его конформация, и он уже не может выполнять свои каталитические функции. Поэтому зависимость скорости ферментативной реакции от температуры имеет вид кривой с максимумом (рисунок)

Максимум соответствует наивысшей активности фермента, которая обычно измеряется его количеством в мг, которое катализирует 1 мгмоль субстрата за 1 мин. Удельная активность измеряется в расчете на 1 мг фермента (мгмоль/мин). Молярная активность (число оборотов или каталитическая константа) рассчитывается на мгмоль фермента (мгмоль/мгмоль ∙×мин), то есть молярная активность показывает, сколько молекул субстрата превращается за 1 минуту одной молекулой фермента.

Кроме температуры на активность ферментов влияют рН среды и присутствие ингибиторов.

Влияние рН на скорость ферментативной реакции

Для большинства ферментативных реакций оптимальное значение рН среды лежит в интервале 5− 9. Кривая зависимости скорости ферментативной реакции от рН является кривой с максимумом (рисунок)

Такой вид кривой обусловлен тем, что существует оптимальное состояние ионизации субстрата и белковой молекулы фермента (её аминокислотных остатков), которое обеспечивает наиболее прочное их соединение в активном центре и, следовательно, наибольшую скорость реакции.

Ингибиторы ферментов

Действие ферментов может быть ослаблено или полностьюподавлено с помощью определенных веществ – ингибиторов . Их действие может быть обратимым и необратимым.

Обратимые ингибиторы обычно связываются с ферментом нековалентными связями и могут быть легко от них отсоединяться, при этом существуют так называемые конкурентные обратимые ингибиторы, которые имеют сходные структуры с субстратом и стремятся, каждый в первую очередь, связаться с ферментом на субстратсвязывающем участкеактивного центра. Если к ферменту Е добавить конкурентный ингибитор I и субстрат S, то образуются два комплекса по реакциям:

Е + S « ES ® Р + Е

Е + I « Е I ≠ Р

Так как образование комплекса ЕI не приводит к образованию продуктов реакции, то скорость реакции их образования уменьшается, так как уменьшается число активных центров фермента, способных взаимодействовать с субстратом. Поскольку конкурентный ингибитор связывается с ферментом обратимо, то уменьшить его действие можно, увеличивая концентрацию субстрата, так как при этом увеличивается вероятность связывания фермента с субстратом. Ингибитор, мешая образованию фермент-субстратного комплекса, он увеличивает константу Михаэлиса К m , но не изменяет V max .

Неконкурентный обратимый ингибитор не сходен поструктуре, с субстратом, поэтому он может связываться с ферментом и в присутствии и в отсутствии субстрата, и обычно связывается с ферментом не в активном центре, а в другом месте, обычно в регуляторном центре. При этом образуется тройной комплекс: фермент-ингибитор-субстрат (ЕSI), который не приводит к образованию продуктов реакции:

Е + S + I ® Е I ≠ Р

При данном типе ингибирования влияние ингибитора не может быть преодолено повышением концентрации субстрата. Неконкурентный обратимый ингибиторуменьшает как V max , так и К m .

Необратимые ингибиторы ферментов – это соединения, которые образуют прочные связи с ферментом, причем именно в активном его центре. Связывая важные группы на субстрат связывающем участке, они необратимо изменяют его конфигурацию. Так необратимо действуют на ферменты ионы тяжелых металлов Hg +2 и Pb +2 , чем объясняется их токсическое действие на организм человека.

Регуляция действия ферментов осуществляется гормонами.

ДИНАМИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

Совокупность химических реакций, протекающих в живых клетках, и обеспечивающих организм нужными ему веществами и энергией носят название обмена веществ или метаболизма. Различают катаболизм и анаболизм. Катаболическое превращение – это расщепление сложных молекул, как поступающих с пищей, так и находящихся в клетке, эти процессы называются экзогоническими.

Анаболические процессы (процессы биосинтеза) направлены на образование и обновление структурных элементов клеток, то есть на синтез сложных молекул из простых. Процессы биосинтеза – это восстановительные процессы и они сопровождаются затратой свободной энергии, такие процессы называются эндергоническими. Обе стороны процесса взаимосвязаны между собой во времени и пространстве. Катаболические и анаболические процессы протекают в различных органеллах клетки, где локализованы различные внутриклеточные ферменты. Все метаболические пути взаимосвязаны, что показано на интегральной схеме метаболических путей.

Кинетика ферментативных реакций. Этот раздел энзимологии изучает влияние хими ческих и физических факторов на скорость ферментативной реакции. В 1913 г. Михаэлис и Ментен создали теорию ферментативной кинетики, исходя из того, что фермент (Е) вступает во взаимодействие с субстратом (S) с образованием промежуточного ферментсубстратного комплекса (ЕS), который далее распадается на фермент и продукт реакции по уравнению:

Каждый этап взаимодействия субстрата с ферментом характеризуется своими константами скорости. Отношение суммы констант скорости распада ферментсубстратного комплекса к константе скорости образования ферментсубстратного комплекса называется константой Михаелиса (Кm). Она определят сродство фермента к субстрату. Чем ниже константа Михаелиса, тем выше сродство фермента к субстрату, тем выше скорость ка тализируемой им реакции. По величине Кm каталитические реакции можно поделить на быстрые (Кm 106 моль/л и меньше) и медленные (Кm 102 до 106).

Скорость ферментативной реакции зависит температуры, реакции среды, концентрации реагирующих веществ, количества фермента и других факторов.

1. Рассмотрим зависимость скорости реакции от количест ва фермента. При условии избытка субстрата скорость реакции пропорциональна количеству фермента, но при избыточном количестве фермента прирост скорости реакции будет сни жаться, поскольку уже не будет хватать субстрата.

2. Скорость химических реакций пропорциональна концентрации реагирующих ве ществ (закон действующих масс). Этот закон применим и для ферментативных реакций, но с определенными ограничениями. При постоян

ных количествах фермента скорость реакции действительно пропорциональна концентрации субстрата, но, только в области низких концен траций. При высоких концентрациях субстрата наступает насыщение фермента субстратом, то есть наступает такой момент, когда уже все мо лекулы фермента задействованы в каталитическом процессе и прироста скорости реакции не будет. Скорость реакции выходит на макси мальный уровень (Vmax) и дальше уже не зависит от концентрации субстрата. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата следует определять в той части кривой, кото рая ниже Vmax. Технически легче определить не максимальную скорость, а ½ Vmax. Этот параметр является главной характеристикой ферментативной реакции и дает возможность определить константу Михаелиса (Кm).

Кm (константа Михаэлиса) – это такая концентрация субстрата, при которой ско рость ферментативной реакции равна по ловине максимальной. Отсюда выводится уравнение Михаэлиса–Ментена скорости ферментативной реакции.

Ферментативная кинетика изучает скорость реакций, катализируемых ферментами в зависимости от различных условий (концентрации, температуры, pH и др.) их взаимодействия с субстратом.

Однако ферменты - это белки, чувствительные к влиянию различных внешних воздействий. Поэтому при изучении скорости ферментативных реакций учитывают, главным образом, концентрации реагирующих веществ, а влияние температуры, pH среды, активаторов, ингибиторов и прочих факторов стараются свести к минимуму и создают стандартные условия. Во-первых, это оптимальное для данного фермента значение pH среды. Во-вторых, рекомендуется придерживаться температуры 25°С, в тех случаях, где это возможно. В-третьих, достигают полного насыщения фермента субстратом. Этот момент особенно важен, поскольку при низкой концентрации субстрата не все молекулы фермента участуют в реакции (рис. 6.5, а ), значит и результат будет далек от максимально возможного. Наибольшая мощность катализируемой реакции, при прочих равных условиях, достигается, если каждая молекула фермента участвует в превращении, т.е. при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса (рис. 6.5, в). Если же концентрация субстрата не обеспечивает полного насыщения фермента (рис. 6.5, б ), то скорость протекающей реакции не достигает максимального значения.

Рис. 65.

а - при низкой концентрации субстрата; 6 - при недостаточной концентрации субстрата; в - при полном насыщении фермента субстратом

Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, и полном насыщении фермента субстратом называют максимальной скоростью ферментативной реакции (V).

Скорость ферментативной реакции, определяемая при неполном насыщении фермента субстратом, обозначается v.

Ферментативный катализ упрощенно можно описать схемой

где F - фермент; S - субстрат; FS - фермент-субстратный комплекс.

Каждая стадия этого процесса характеризуется определенной скоростью. Единицей измерения скорости ферментативной реакции служит количество молей субстрата, превращаемое в единицу времени (как и скорость обычной реакции).

Взаимодействие фермента с субстратом приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, но этот процесс обратимый. Скорости прямой и обратной реакций зависят от концентраций реагирующих веществ и описываются соответствующими уравнениями:

В состоянии равновесия справедливо уравнение (6.3), поскольку скорости прямой и обратной реакции равны.

Подставив значения скорости прямой (6.1) и обратной (6.2) реакции в уравнение (6.3), получим равенство:

Состояние равновесия характеризуется соответствующей константой равновесия К р, равной отношению констант прямой и обратной реакций (6.5). Величина, обратная константе равновесия, называется субстратной константой K s , или константой диссоциации фермент-субстратного комплекса:

Из уравнения (6.6) ясно, что субстратная константа уменьшается при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса, т.е. при большой его устойчивости. Следовательно, субстратная константа характеризует сродство фермента и субстрата и соотношение констант скоростей образования и диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Явление насыщения фермента субстратом изучали Леонор Михаэлис и Мод Мептен. На основе математической обработки результатов ими было выведено уравнение (6.7), получившее их имена, из которого ясно, что при высокой концентрации субстрата и низком значении субстратной константы скорость ферментативной реакции стремится к максимальной. Однако это уравнение носит ограниченный характер, поскольку учитывает не все параметры:

Фермент-субстратный комплекс в процессе реакции может подвергаться превращениям в разных направлениях:

• диссоциировать на исходные вещества;
• превращаться в продукт, от которого отделяется фермент в неизменном виде.

Поэтому для описания суммарного действия ферментативного процесса введено понятие константы Михаэлиса К т, которая выражает взаимосвязь констант скоростей всех трех реакций ферментативного катализа (6.8). Если оба слагаемых разделить на константу скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса, то получится выражение (6.9):

Из уравнения (6.9) вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше субстратной константы на величину k 2 /k v

Численно К т равна такой концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимально возможной скорости и соответствует такому насыщению фермента субстратом, как на рис. 6.5, б. Поскольку на практике не всегда удается достичь полного насыщения фермента субстратом, то именно К т используется для сравнительной характеристики кинетических характеристик ферментов.

Скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом (6.10) зависит от концентрации фермент-субстратного комплекса. Коэффициентом пропорциональности служит константа реакции освобождения фермента и продукта, поскольку при этом меняется концентрация фермент-субстратного комплекса:

После преобразований, с учетом представленных выше зависимостей, скорость ферментативной реакции при неполном насыщении фермента субстратом описывается уравнением (6.11), т.е. зависит от концентраций фермента, субстрата и их сродства K s:

Графическая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата не является линейной. Как очевидно из рис. 6.6, с увеличением концентрации субстрата наблюдается рост активности фермента. Однако при достижении максимального насыщения фермента субстратом скорость ферментативной реакции становится максимальной. Следовательно, фактором, ограничивающим скорость реакции, является образование фермент-субстратного комплекса.

Практика показала, что концентрации субстратов, как правило, выражаются значениями намного меньше единицы (10 6 -10 3 моль). Оперировать такими величинами в расчетах довольно сложно. Поэтому Г. Лайнуивер и Д. Берк предложили выражать графическую зависимость скорости ферментативной реакции не в прямых координатах, а в обратных. Они исходили из предположения, что для равных величин равны и обратные им значения:

Рис. 6.6.

После преобразования выражения (6.13) получается выражение, называемое уравнением Лайнуивера - Бэрка (6.14):

Графическая зависимость уравнения Лайнуивера- Берка носит линейный характер (рис. 6.7). Кинетические характеристики фермента определяются следующим образом:

• отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V;
• отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен -1 /К т.

Рис. 6.7.

Считается, что метод Лайнуивера - Берка позволяет более точно, чем в прямых координатах, определить максимальную скорость реакции. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирования фермента.

Существуют и другие способы преобразования уравнения Михаэлиса- Ментен. Графические зависимости используют при изучении влияния различных внешних воздействий на ферментативный процесс.

Свойства ферментов

1. Зависимость скорости реакции от температуры

Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента . Повышение скорости реакции при приближении к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул.

Зависимость скорости реакции от температуры

Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем.

Как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров, у них оптимум температуры приближается к точке кипения воды. Примером слабой активности при низкой температуре может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.

Ферменты могут быть очень чувствительны к изменению температуры:

• у сиамских кошек мордочка, кончики ушей, хвоста, лапок черного цвета. В этих областях температура всего на 0,5°С ниже, чем в центральных областях тела. Но это позволяет работать ферменту, образующему пигмент в волосяных луковицах, при малейшем повышении температуры фермент инактивируется,
• обратный случай - при понижении температуры окружающего воздуха у зайца-беляка пигментообразующий фермент инактивируется и заяц получает белую шубку,
• противовирусный белок интерферон начинает синтезироваться в клетках только при достижении температуры тела 38°С,

Бывают и уникальные ситуации:

• для большинства людей повышение температуры тела на 5°С (до 42°С) несовместимо с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых спортсменов обнаружено, что при марафонском беге их температура тела составила около 40°С, максимальная зарегистрированная температура тела была 44°С.

2. Зависимость скорости реакции от рН

Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.

Данная особенность ферментов имеет существенное значение для организма в его адаптации к изменяющимся внешним и внутренним условиям. Сдвиги величины рН вне- и внутри клетки играет роль в патогенезе заболеваний, изменяя активность ферментов разных метаболических путей.

Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.

Зависимость скорости реакции от величины pH

Зависимость активности от кислотности среды объясняется наличием аминокислот в структуре фермента, заряд которых изменяется при сдвиге рН (глутамат, аспартат, лизин, аргинин, гистидин). Изменение заряда радикалов этих аминокислот приводит к изменению их ионного взаимодействия при формировании третичной структуры белка, изменению его заряда и появлению другой конфигурации активного центра и, следовательно, субстрат связывается или не связывается с активным центром.

Изменение активности ферментов при сдвиге рН может нести и адаптивные функции. Так, например, в печени ферменты глюконеогенеза требуют меньшей рН, чем ферменты гликолиза , что удачно сочетается с закислением жидкостей организма при голодании или физической нагрузке.

Для большинства людей сдвиги величины рН крови за пределы 6,8-7,8 (при норме 7,35-7,45) несовместимы с жизнью из-за дисбаланса скорости ферментативных реакций. В то же время у некоторых марафонцев обнаружено снижение рН крови в конце дистанции до 6,8-7,0. И ведь при этом они сохраняли работоспособность!

3. Зависимость от количества фермента

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.